成功植入胰腺干细胞的步骤

   成功植入胰腺干细胞的步骤     

1、细胞的制备；细胞的来源：采用流产人胚胎（5-7月胎龄）胰腺组织，于解剖显微镜下去除周围的脂肪和结缔组织。轻轻地分离并切碎胰腺，胶原酶370C震胰荡消化30分钟，然后加冷牛血清和Hanks液保护细胞并终止消化。此方法不但可以分离外分泌腺，还可以降低免疫原性从而减少免疫排斥反应。1500转离心10分后弃上清，用生长液保存具有生理功能的细胞备用，达到细胞量再行植入。

　　 2、胰腺干细胞的制备：由于胚胎数量不足，往往不能满足胰岛细胞种植的需要，就须在体外进行扩增，达到种植的细胞量。方法同胰岛细胞的制备，在细胞终止消化后静置10分，弃上清，0。25%胰蛋白酶370C消化至细胞悬液，在无糖DMEM培养基（含非必需氨基酸，B27）中培养。两天后换液加入终浓度为10µg/ml的KGF，1mg/ml的ITS。以后每三天换液一次并改换培养基的成分为葡萄糖浓度为17。8mmol/L，10mmol/L尼可酰氨，2%胎牛血清（诱导）其他营养成分不变，观察其生长情况并在其6-7天时进行传代（扩增）。

　　 3、细胞植入：当胰岛细胞和胰腺干细胞的数量达到糖尿病人种植时，先进行细胞的生理功能鉴定及病毒和细菌培养，排除病毒和污染后再行移植。

　　 ㈠、细胞数量是影响种植成功的关键因素，因此每个人种植的数量是不同的，严格按每公斤体重6000个胰岛当量以上进行植入。

　　 ㈡、细胞的纯度，即将培养好的胰腺细胞采用双硫腙染色以平板计数法结合EIN法对胰岛阳性细胞计数，通常细胞纯度在80%左右。

　　 ㈢、细胞活性鉴定：采用吖啶橙和碘丙啶对细胞进行染色，吖啶橙染色后在荧光显微镜下活细胞呈绿色荧光，死亡的细胞碘丙啶染色结合后发出红色荧光。细胞染色后活度要达到90%以上。

　　 4、降低免疫原性：防止免疫排斥反应是植入细胞成功的关键之一，当细胞在制备中370C消化30分钟，即可降低其免疫原性；应用免疫抑制剂对防止植入细胞后的急性排斥反应很重要，成人植入后，联合应用免疫抑制剂包括环孢素A、硫唑嘌呤、霉酚酸脂、他克莫司等。约服用一个月的免疫抑制剂无免疫排斥反应即可停用。5-20岁处在生长发育期慎用或不用，或改用不影响发育的免疫排斥剂。