大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT的操作步骤

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT背景:

大鼠2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)ELISA KIT用于测定人血清，血浆及相关液体样本中2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的含量。

实验原理：

试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)水平。用纯化的人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)，再与HRP标记的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的。颜色的深浅和样品中的2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)浓度。

操作步骤

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为2400nmol/L，1600nmol/L，800nmol/L，400nmol/L，200nmol/L。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：

用封板膜封板后置37℃温育3 0分钟。

4.配液：

将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：

每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：

操作同3。

8.洗涤：

操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：

每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转）。

11.测定：

以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。