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兔抗鼠血清的应用

背景[1-3]

兔抗鼠血清是将鼠IGG抗原分子分别以弗氏*佐剂（油包水溶性抗原分子）或弗氏不*佐剂，及水剂相结合的剂型免疫注射于兔子等实验动物的不同部位，产生高效价抗体后，经无菌低温分离制成。免疫血清可广泛的应用于医学、生物学的各个学科，特别在临床免疫测定和免疫病理的诊断中更是必-备之材。

这里提供的抗血清产品经过脂类抽提以提高透明度，经去盐和透析处理以去除包含叠-氮-化-钠的磷酸缓冲液，并后冻干以获得冻干粉末。其中针对全血清蛋白的抗血清是通过完整血清免疫宿主动物获得，而针对所有IgG分子的抗血清则可与PAP联用。

兔抗鼠血清

抗原的免疫方案根据其性质不同而异以制备兔抗鼠IGG抗血清为例:

（1）抗原乳化：称取羊毛脂10g于研钵中，、逐滴加入石腊油40ml，逐滴研磨，高压灭菌后备用。将上述不*福氏佐剂预热至60℃，取3ml，逐滴加入0.5ml BCG（75mg/ml），继续加入2.5ml人C3蛋白（2.4mg/ml），边滴入边研磨，直至达到“油包水"状态。

（2）动物免疫：选取健康新西兰兔（3Kg左右），消毒局部皮肤，用1ml注射器吸取1ml乳化抗原，于兔每只脚掌皮下注入0.5ml。间隔2周后，将1ml乳化抗原多点（5－10点）注入兔腘窝及背部皮下。间隔2周后，在1周内分别3次通过兔耳静脉注射2.4mg/ml人C3蛋白液（分别为0.1ml、0.3ml、0.5ml），间隔1周后采用双向免疫扩散测定抗血清效价，当效价达到1：16以上即可放血。

（3）放血：可采用颈动脉放血法和心脏采血法。

（4）鉴定：采用双向免疫扩散或ELISA测定抗血清效价。

（5）保存：抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。

兔抗鼠血清的应用

用于FcγRⅡb在小鼠抗病毒免疫中的作用研究

以鼠FcγRⅡb的胞外域去除信号肽部分的基因序列为模板,设计特异性引物。以鼠肺泡巨噬细胞总RNA反转录的cDNA为模板,用PCR方法,扩增FcγRⅡb胞外域目的片段,得到长度为555bp的目的片段。将回收的FcγRⅡb胞外域片段连接到pET-28a载体中,经鉴定测序正确后命名为pET-28a-FcγRⅡb。之后将其转化到BL21（DE3）菌株中进行表达,用摸索的佳条件大量诱导表达FcγRⅡb胞外域蛋白,用摸索的佳尿素浓度纯化蛋白,纯化的FcγRⅡb蛋白测过含量后分装,-40℃保存。

将纯化的FcγRⅡb胞外域蛋白与弗氏佐剂按1:1.2的比例制成免疫原,按1mg/kg免疫新西兰大白兔,经ELISA方法检测,兔抗鼠FcγRⅡb血清效价达到为1:12800时大量采血收集血清。经Western blot检测,兔抗鼠FcγRⅡb抗体具有很强的特异性。用过硫酸铵粗提和ProteinG Sapharose 4xFast Flow柱子纯化兔抗鼠FcγRⅡb IgG。纯化后兔抗鼠FcγRⅡb IgG经ELISA检测其效价达到1:25600。激活FcγRⅡb后鼠腹腔巨噬细胞中天然免疫相关细胞因子的变化规律将从健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬细胞用含10%血清的RPMI-1640培养基稀释到106个/mL,每孔500μL在24孔细胞培养板中培养,将纯化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔阴性IgG稀释到500μg/mL,激活组和阴性对照组每孔加入200uL稀释后的IgG,处理鼠腹腔巨噬细胞。

分别在处理鼠腹腔巨噬细胞后的12、24、36、48h收取各孔中的细胞,提取总RNA并反转录成cDNA。采用RT-qPCR方法检测天然免疫相关细胞因子IRF3、IFN-αIFN-β、IFN-γ、TNF-α、1L-1β、TGF-βmRNA水平,结果显示,激活FcγRⅡb在12-48h上调巨噬细胞中干扰素调节因子IRF3,干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β,和Toll样受体TLR3的mRNA水平,下调免疫抑制因子TGF-βmRNA水平。说明鼠FcγRⅡb的激活能上调巨噬细胞的天然免疫能力。

激活FcγRⅡb在鼠腹腔巨噬细胞在抗病毒免疫中的作用将从健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬细用含10%血清的RPMI-1640培养基稀释到106个/mL,每孔500μL在24孔细胞培养板中培养,将纯化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔阴性IgG稀释到500μg/mL,每孔200μL处理鼠腹腔巨噬细胞,作用2h后弃去上清,然后接种MHV,培养2h后将其弃去并补加维持液。

分别在补加病毒维持液后的12、24、36、48h时,收取各孔细胞并提取总RNA反转录成cDNA,采用RT-qPCR方法测定MHV的拷贝数和天然免疫相关细胞因子的mRNA水平。结果显示,FcγRⅡb IgG-MHV试验组与兔阴性IgG-MHV组和MHV组相比,FcγRⅡb的激活仍能上调巨噬细胞中干扰素调节因子IRF3,干扰素IFN-αIFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR3的mRNA水平,下调免疫抑制因子TGF-βmRNA水平,而且FcγRⅡb IgG-MHV试验组病毒拷贝数在24-48h低于阴性IgG-MHV对照组和MHV对照组。