通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆

通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆

经过3～4轮的筛选后，应该能够富集到能与受体特异性结合的噬菌体群体。通常而言，在后几轮的筛选中，每次获得的噬菌体总量都会增加，但是单就这个现象并不一定能说明已经筛选到了受体特异性结合的肽段。能与靶分子非特异性结合或者能与筛选基质的噬菌体克隆也会造成这一现象。噬菌体ELISA可以说是zui灵敏的鉴定所获取的噬菌体克隆结合特异性的方法之一。受体被包被在各孔中，与之结合的噬菌体通过辣根过氧化物酶偶联的抗M13噬菌体抗体检测。只含有捕获抗体或者牛血清白蛋白的孔用来作为阴性对照。作为竞争性结合物的已知的配体可以加入到噬菌体中来分辨竞争性肽和非竞争性肽。值得注意的是，这个实验所用的条件是为了使检测的灵敏度zui大化，而不是基于所展示肽段的内在亲和性来分辨各个克隆的。多价结合、表达量的差异以及每个肽段对蛋白酶的敏感性都将很大地影响信号的强弱。
通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆
另一个用来从富集的噬菌体群体中发现受体特异性克隆的方法是用受体作为探针来检测克隆黏附。这是通过将感染了所筛选的噬菌体的细菌细胞于LBamp/kan琼脂糖乎板上培养，其中培养基含有与液相扩增噬菌体相同浓度的葡萄糖和阿拉伯糖。将从细胞中排出的噬菌体转移到硝酸纤维薄膜上后，用标记了的靶分子探测（通常是放射性标记）。此方法的灵敏度要低于噬菌体ELISA，但是它提供了一个快速的大规模分析克隆的方法，并且对于发现高亲和力的序列可能有作用。
通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆
通过对阳性克隆的p8V5载体的插入DNA片段测序，将可以推演出对应的肽段序列。

[器材和试剂]
● 辣根过氧化物酶标记抗M13噬菌体抗体（HRP-conjugated anti-M13 antibody）（Amersham Biosciences）
● ABTS显色缓冲液[50mmol/L柠檬酸，用NaOH调节pH至4．0，0．22mg/m1 2，2，-连氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）；使用之前加入0．05％的双氧水]
● Q1agenPlasmidMini Kit试剂盒（Q1agen）
● p8V5反向测序引物（5，-TGAGGCTT-GCAGGGAGTC-3，）

[方法]
1．从噬菌体滴定平板挑取单克隆，并接种到5mlSOPamp/glu培养基中。于37℃振摇培 养直至OD600值达到0.5。
2．加入VSC-M13辅助噬菌体（1X109pfu），于37℃静置孵育30分钟。
3．加入50tzl 20％阿拉伯糖溶液和5ul 20mg/ml卡那霉素溶液。于37℃振摇培养过夜。
4．于3400r/min转速（台式离心机） 离心细菌15分钟，将含有噬菌体的上清转移到一个新的离心管中。
5．按照实验方案6．5所述，将受体固定在96孔酶标板中。每孔中加入50rdPBS/1％BSA和50ul噬菌体上清，于4℃孵育2小时。
6．使用PBS洗板5次。用PBS/1％BSA溶液，按1：5000比例稀释辣根过氧化物酶标记 抗M13噬菌体抗体，并于每孔中各加入50/11稀释液。于4℃孵育1小时。
7．使用PBS洗板5次。于每孔中加入100ul ABTS显色缓冲液，室温孵育直至颜色显现。用酶标仪测定405 nm波长时的吸光度。
8．按照厂商说明书，用QiagenPlasmidMiniKit试剂盒抽提在ELISA反应中显阳性的噬菌体双链DNA。按双脱氧测序法ti4]使用p8V5反向测序引物测定DNA序列。