PCR-ELISA法诊断禽流感

PCR-ELISA法诊断禽流感
PCR-ELISA是将一步RT-PCR技术与酶联免疫吸附法相结合，检测病毒的一项诊断技术。PCR的一对引物中，其中一个用生物素标记、另一个用地高辛标记，在酶标微孔板上用亲和素包被，PCR扩增后纯化片段加入微孔板中。此时，微孔板上包被的亲和素将与生物素标记引物上的生物素特异性结合而捕捉了PCR片段，然后在微IL板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与地高辛标记引物上的地高辛结合，从而形成亲和素-生物素-PCR片段-地高辛-地高辛抗体-辣根过氧化物酶复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统、灵敏度更高。同时这种方法避免了PCR产物分析时，电泳的电极及染色过程，所以更为快捷、简便和灵敏。丹麦学者MMunch等建立的RT-PCR-ELISA方法，比常规RT-PCR敏感10～100倍，1个毒株（EID50＝10-84）的感染性尿囊液经10-7稀释仍能检出，与鸡胚病毒分离的敏感性一致。
PCR-ELISA法诊断禽流感
国内亢文华等针对高致病性禽流感H5亚型病毒的包含多碱性氨基酸裂解位点特异性片断，设计用生物素和地高辛标记的特异性引物，从活禽咽拭子、肛拭子、粪便及病死禽组织病料中扩增标记RT-PCR产物，再以ELISA方法，用生物亲和素包被的微量板孔中杂交捕获RT-PCR产物·，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合，从而形成生物亲和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗体-酶的复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR技术和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统，即PCR放大和ELISA放大，试验证实它的灵敏度已经超过鸡胚分离法（荧光PCR检出的zui低稀释度为10-6.67，鸡胚分离检出的zui低稀释度为10-7.67，PCR-ELtSA检出的zui低稀释度为10-8.8），证明本方法具有较高的敏感性，比普通PCR和荧光PCR更为快捷、简便、灵敏，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程。
PCR-ELISA法诊断禽流感