酶标记抗体法标记抗体的制备

酶标记抗体法标记抗体的制备

酶标记抗体法（enzaymelabelledantibodytechnique）是用结合物将酶结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗原—抗体反应使抗原—抗体复合物上带有酶分子，再借助酶对底物的特异性催化作用，在抗原—抗体反应部位形成不溶性有色产物，用于研究抗原物质分布和性质。酶标记抗体法又分为直接法和间接法， 目前应用zui多的酶是辣根过氧化酶（HRP），底物是3，3’—二氨基联苯胺（DAB）。
 

抗体蛋白分子与酶分子（如HRP或AKP）以一定的方式相互交换，形成酶标记抗体，故称酶标抗体或酶联抗体，它是IHC酶标记抗体法的主要试剂，其质量好坏将直接影响到方法的敏感性和特异性。HRP可以以共价键或非共价键方式黏附在其他的蛋白质分子上，常见的标记方法有戊二醛一步法和二步法，也可以用过碘酸钠氧化法，它们主要为共价键结合方式（反应式见图4—2和图4—3）；

另一种非共价键结合方式是用4，4’—二氟—3，3，—二硝基苯基砜（4，4／—difluoro-3，3，—dinitrophenylsulfone，FNPS）作为交联试剂，该方法不常用。戊二醛二步法的标记效率要高于一步法，过碘酸钠氧化法要高于戊二醛二步法。其主要原理是二种蛋白质分子的赖氨酸上的e基团和含氨基的N端经活化剂活化而结合。由于抗体和酶分子上所具有的反应基团很少，需通过功能基团（如戊二醛）将更多的抗体和酶分子结合在一起，酶分子首先和双功能试剂结合，再与抗体分子结合。这样可以结合更多的酶和抗体，而且无聚合物产生。HRP还可以与生物素和亲和素结合。
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