原位杂交

原位杂交
基本定义
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交！使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。

RNA原位杂交
1、RNA原位核酸杂交又称RNA组织化学或RNA。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种技术。
2、基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体（Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为zui有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

FISH
FISH是技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。
基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中zui常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。荧光标记探针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。

例子
　　以菌落为例：
　　对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上
　　（1） 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
　　（2） 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种（或打点）。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。zui后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322）的菌落。
　　（3） 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
　　（4） 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
　　（5） 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。
　　（6） 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。

2. 菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜
　　（1） 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。
　　（2） 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH重复步骤（1）。
　　（3） 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris·Cl（pH7.4）的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。
　　（4） 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl （pH7.4）的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。
　　（5） 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定DNA。
　　（6） 将固定在膜上的DNA与32 P标记的RNA进行杂交。
3.杂交　
（1） 盛有2×SSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,*浸湿5分钟。
　　（2） 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。
　　（3） 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。
　　（4） 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度（即在水溶液中杂交时用68℃，而在50%甲酰胺中杂交时用42℃）下,预杂交1-2小时。
　　（5） 将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。
　　（6） 杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。
　　（7）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次,每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。
　　（8） 把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜（编号面朝上）放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。
　　（9） 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。
　　（10） 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。

的应用
　　①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；
　　②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；
　　③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；
　　④基因在染色体上的定位；
　　⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；
　　⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。

的意义
　　：在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 双键分子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA 的存在并定位；用技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。