抗血清的制备

原理：
抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。
一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定簇（Antigenic
determinant），另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应。
抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫动物需加用佐剂，尤其在使用可溶性抗原时，以期得到价的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。

材料：
1、金属编号牌（对动物作标记录）或染料；
2、1毫升，5毫升、20毫升注射器；
3、采血针头（9#，12#），卡价苗针头（41/2 # — 51/2 #）；
4、灭菌平皿，疫苗瓶，青霉素瓶，皮塞以及吸管，脱脂棉；
5、卡介苗（75mg/ml）；
6、抗原（小鼠血清）；
7、青霉素溶液，链霉素溶液和5%葡萄糖溶液；
8、液体石腊（医用），羊毛腊（配制佐剂用）；
9、灭菌生理盐水，消毒用酒精，2.5%碘酒；
10、1.5%琼脂，玻板，饭盒（保湿、保湿作用）；
11、实验动物（家兔）。

步骤
1、动物的选择
羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔都是常用的免疫动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。免疫用动物应选适龄、健壮．为雄性。zui常用的实验动物是家兔，一般选择选择年龄在6个月以上当年繁殖的♂性，体重2 ～3公斤，健康家兔三只，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。
2、抗原制备
1）抗原稀释：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/ml，于免疫前一天加入青霉素溶液，使每毫升抗原溶液含青霉素1000 UI，链霉素1000
UI，放4℃过夜（一般可不加青、链霉素）次日取出，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。对于纯的可溶性抗原的免疫剂量，通常小鼠抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100μg ～1 mg/次，合成免疫原为2
mg（半抗原约为20～200μg），一般需要与等量的福氏*佐剂混合。加强免疫的剂量为计量的1/2，通常用不*福氏佐剂或不用佐剂。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。
2）佐剂和抗原乳剂的配制
1佐剂的配制：福氏*佐剂（Freund’s complete adjuvant），各实验室的配方不尽相同，我室采用的配方如下：
医用液体石腊 20毫升
羊毛脂 12克
水浴溶化、混匀，分装于青霉素小瓶，用纱布、线绳扎紧瓶塞。8磅20分钟灭菌，4℃保存备用。于免疫前准备抗原乳剂制备时，以活卡介苗（有时亦用死卡介苗）代替死结核菌，每毫升试剂中加入10mg活卡，即为福氏*佐剂。
2抗原乳剂的制备：其方法一般有两种，其一，将等量的*佐剂（注意佐剂必须预先加热融化，但不超过50℃）和抗原溶液分别吸入两个5ml注射器内，在两个注射器的12#
针头间套上一根长约8～12cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起（塑料管必须先经酒精浸泡消毒，使用时取出，用灭菌生理盐水冲洗后，与注射器针头相连接，塑料管与针头的口径须合适，不能松，稍紧些为宜），针头插进塑料管约1～2cm然后由两人相对而坐后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，每次推动针蕊时必须把管内容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，直至形成油包水乳剂（Water-in-oil enulsion）为止。
其二是，将等量的佐剂和抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，也可形成油包水乳剂，该法主要优点是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附过多，浪费佐剂及抗原。
制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，因此，必须进行质量检查，检查的方法是将制成的乳剂滴一滴在凉水（自来水）表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者进入水面后立即扩散，水面油亦逐渐扩大，这就必须要继续操作至质量合格为止。
但有时，由于佐剂的配制质量原因，很难乳化至合格，遇有这种情况，须考虑重新配制佐剂。
3、免疫途径，剂量和免疫周期
抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下或腹腔注射加强免疫。
1）常规（皮内多点注射）免疫：
1*次免疫：剂量为每只兔子注射1.0 ml抗原乳剂（含抗原量1～2mg）。注射部位为两只后脚掌的皮内各注射0.2 ml，其余0.6
ml分多点注入脊柱二侧，颈部，腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入0.05ml，分12点注入。
2第二次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0ml/只（1～2 mg/ml），加福氏不*佐剂。注射部位在腹部皮下多点注射，每点注入0.1 ml。
3第三次免疫：再次免疫后两周内进行，注射剂量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少许静脉血，分离血清，试血测定效价。
2）淋巴结免疫：主要优点是可减少抗原用量。过程如下：
1卡价苗致敏：免疫前足掌皮下每侧各注入活卡价苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右观察两侧腘窝淋巴结，一般可肿胀如蚕豆大小，此时即可进行淋巴结内免疫注射。
2*次免疫：用手淋巴结后在两侧腘窝淋巴结内各注入抗原乳剂0.25ml，每只兔总量0.5 ml；为加强免疫，于初次免疫20天后，于腹部皮下多点注射不加佐剂抗原溶液1mg/1ml。
3二周后可如同*次免疫的剂量和途径再注射一次，一般可在第三次免疫注射前试血滴定效价，效价如已达到要求可不必进行第三次免疫。
有条件的情况下，免疫后要加强动物饲料管理，如给熟黄豆饲养等。
3）腹腔免疫：一般不必加佐剂，适用于细胞性或颗粒性抗原，而且抗原性较强者，例如用绵羊红细胞免疫家兔或小鼠即可用此法。
4、试血，测定抗体效价
一般在第三次免疫后7～10天即可于兔耳静脉或小鼠尾尖取少量血，分离出血清之后进行试血。
① 环状试验，较为经典的方法，目前较少采用，如与20μg/ml以下的抗原于30 min内能出现“艹”的沉淀环，即测定抗体效价达1：5000以上时为合格。
② 免疫双扩散法，这是zui常用的试血方法，其具体方法是，中间孔加稀释的抗原（1mg/ml）10μl，周围孔顺时针方向加制备的抗血清分别为1:2, 1:4,
1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理盐水或PBS稀释）。经37℃保温24h后观察结果，效价在1:16以上即可决定放血。
5、放血
经效价检查合格后即可放血。放血前动物应停食12 h，以减少血清中的脂肪含量。如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血，或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄溶液以补足失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血。如拟一次放血致死，可用颈动脉放血的方法，各种取血方法如下。
1）心脏取血：固定动物于仰卧位置，用食指探明心脏博动量高部位（在胸骨左侧，由下向上数第3与第4助骨之间，指兔），剪去少许毛，用2.5%
碘酒和75%酒精消毒后，以9#针头在预定位置与胸部呈45。角刺入心脏，微微上下移动针头，待见血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。2.5公斤体重的家兔一次可取血20～30ml。
2）耳缘静脉滴血：先将耳缘静脉附近的毛剪去用无菌棉球将皮肤擦干净（不用酒精消毒，避免溶血）。用台灯照射耳部使血管因温度增高而扩张，然后用无菌刀片将耳缘静脉切一长0.5cm的纵切口，*次切口应从耳尖部开始，以后再切时，逐步向耳根方向移动。用无菌试管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不畅时，可用无菌棉棒轻轻将切口外血凝块擦去（注意勿使切口损伤太大），血流仍可继续流出，直至达到所需要的血量为止。取血后用无菌棉球压迫切口止血。耳缘静脉取血一次可取血50ml左右而动物不死。
3）颈动脉放血：使动物仰卧固定四肢，颈部剪毛、消毒后纵向切开前颈部皮肤长约10cm，用止血钳将皮肤分开夹住，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm，选择血管中段，用止血钳夹住血管壁周围的筋膜。远心端用丝线结扎，近心端用动脉钳夹住，用酒精棉花球消毒血管周围，用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段，将一端剪成针头样斜面，并将此端插入颈动脉中，另一端放入200ml无菌三角瓶内，然后放开止血钳，血即流入三角瓶内，动物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。
6、分离血清
必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前必须经过签定合格后再分装保存备用。
7、抗血清的保存
1）经签定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其zui后浓度分别为0.01%或0.05%。
2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。
3）-20℃以下保存，可保存2年以上。
4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久

注意事项
1、动物的免疫反应存在着个体差异，甚至有人报告不同品种动物一次免疫后产生的抗体的差别可高达500倍，所以制备抗血清时不能只免疫一只动物，一般免疫3～4只，因为有的动物可能产生抗体效价很低或不产生抗体，免疫反应好的动物所能提供的抗体往往高于一般动物3～4倍。
2、制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，如不是油包水乳剂，应重新制备。
3、要制备价的抗体，必须要加佐剂（一般采用*福氏佐剂），加佐剂后免疫动物，抗体效价至少可增加5倍。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
4、分装保存的抗血清应注明抗血清的名称，效价，制备日期以及包装量。
5、当抗原量过少不易提纯时，可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。
6、抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。血清效价的检测方法很多，灵敏度各不同，因此在表示抗血清效价时，应标明检测方法。另外，在沉淀反应中，出现沉淀时的抗原、抗体比例有一较大的范围，如用不同浓度的抗原测定效价时，结果会因此有别，所以在测定抗血清效价时，需注意抗原的浓度。
7、为制备单价特异性高的抗血清，所用抗原纯度越高越好，因此，在纯化抗原过程中应尽量除去可能存在的杂蛋白，这样可以省去许多时间来吸收抗血清中的非特异性抗体。




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