酶免疫测定的酶—大分子蛋白结合物的制备

 

    酶结合物可以说是酶免疫测定试剂盒的核心组成部分。通常酶免疫测定试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的。因为在酶免疫测定试剂盒中，zui易受外环境影响的组成试剂即是酶结合物。此外，酶结合物的质量亦是影响试剂盒质量的很重要的因素之一，可见酶结合物的制备对于酶免疫测定来说，是非常关键的一个环节。

 

    酶—抗体（或其他大分子蛋白）结合物是酶免疫测定的有机组成部分，也是其测定基础之所在。通常，酶结合物（酶标抗体或抗原）一般均是通过化学交联而得到的。一个理想的化学交联方法应能得到分子组成明确、酶及抗体或抗原不失活、连接键稳定且经济的*耦合的结合物。

 

    酶—蛋白的耦合方法可分为三大类，即①酶与蛋白的随机共价交联方法；如戊二醛方法；②通过特定化学基团进行共价交联的方法，如过碘酸钠方法及采用各种均一和非均一双功能交联剂的方法；③通过非共价键交联的方法，如酶—抗酶免疫复合物方法。这些方法各有其优缺点，如戊二醛方法，由于交联的随机性，所得到的酶结合物大小不一，其中许多分子量很大，超过1 000kD，这样的酶结合物的酶活性与游离酶相比，将大大降低。此外，大分子的酶结合物在免疫测定还有可能对测定形成空间位阻。使用过碘酸钠方法制备酶结合物，操作简单，所得到的酶结合物大小合适，酶的活性可以保留80％以上。酶—抗酶免疫复合物这种非共价键交联方法并非严格意义上的酶—蛋白耦联方法，本处不做介绍。

 

下面介绍几个具体的酶与蛋白大分子的交联方法。

 

    1、过碘酸钠方法

    Nakame和Kawaoi于1974年设计了这种可用于糖蛋白且极为有效的化学耦联方法，以后又有人对这种方法进行了改良，这种改良方法是目前用于HRP标记抗体或抗原的zui常用的方法。与GA方法比较，这种方法的得到的耦联物的产率至少要高3～4倍。方法的原理如下：过氧化物酶的所有氨基首先用1—氟—2，4—二硝基苯（Sanger试剂）（DNFB）不可逆地封闭，然后用Nal04氧化过氧化物酶的糖链（占总重量的21％），产生醛基和羧基，醛基与所加入的蛋白（1gG或SPA）的游离氨基形成Schiff碱（但不与本身已封闭的氨基作用），这种不稳定的氨基—羰基化合物可用硼氢化钠（NaBH：）还原形成稳定的耦联产物（图6—1）。这种方法大约会使70％的过氧化物酶和约99％的IgG耦联。每个IgG分子zui多可耦联5—6个过氧化物酶分子。如要得到每个IgG分子结合酶分子的一定比，可在理论上计算出应加入到抗体中的活化的过氧化物酶的量。

 

    2、使用化学交联试剂耦联酶与抗体或其他蛋白

    用于酶与抗体或其他蛋白耦联的所有化学交联试剂至少要有两个反应基团，根据其两个反应基团是否相同分为均一的和非均一的交联试剂。均一的双功能交联剂，其两个反应基团相同；而在非均一的双功能交联剂中，两个反应基团不同，每个基团可能于不同的条件下反应。理论上，非均一交联剂的基团的结合反应易于控制。一般来说，均一的双功能试剂只能用于一步法，即将酶和其他蛋白（例如抗体、抗原、SPA或亲合素）与交联剂一起混合后反应。一步法难于控制结合物的大小和组成。如果第二个基团的活化要求不同的条件或待交联蛋白之一与该交联剂反应不强时，某些均一的双功能交联剂亦可用于两步方法。