ELISA试剂盒实验操作中常见问题明细

由于ELISA试剂盒具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA 实验 重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA 实验 结果各因素有一定的认识。的试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD 值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA 实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。
1 标本及采集、贮运因素
（1）严重溶血 ，以 HRP 为标记的ELISA试剂盒测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；
（2）混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；
（3）如有细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；
（4）标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；
（5）采血试管洗涤不* 、反复使用易交叉污染；
（6）塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD 值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
2、试剂的影响
ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有*的*性，就 HCV-ELISA 试剂盒来讲，*代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了 基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。
基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：
基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。
合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：
a.分子量太小；
b.一般只含有一个抗原决定簇；
c.纯度高；
d.稳定性差。
国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A 值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 1） 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。 2） 要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为 1 年。选择刚出厂的试剂使用。 不同厂家的试剂不能混用。 不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用 ELISA 检测HBsAg 结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。
3、操作技术的影响
操作过程的控制：
（1）严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。
（2）加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗*。
（3）封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。
（4）用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。
（5）合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。
（6）加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
（7）显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB 显色剂不用。
（8）加样时保持显色剂不外流；A、B 液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
（9）应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。
以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。ELISA试剂盒从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的 实验结果。