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小鼠单个核细胞分离一步梯度法去除死细胞

2010-06-24 [2057]
基本原理
活细胞（密度较小）和死细胞（密度较大）密度不同，从而有助于将活的淋巴细胞和红细胞分离。
 
附加材料
高密度溶液：Ficoll-Paque（Ficoll和泛影酸钠；Pharmacia LKB）或Lympholyte-M（Cedarlane）
12ml或50ml聚丙烯离心管（比聚苯乙烯离心管好）
注：Ficoll-Paque和Lympholyte-M的密度与温度有关；该方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液适合在室温中使用。因此应注意使细胞悬液、离心和高密度溶液控制在室温。否则会因活细胞沉入离心管底导致在密度界面上损失活细胞。
 
实验方案
1、用RPMI-5*培养基混悬细胞，分装到离心管中使其细胞数达到0.5×108～1×108个细胞/2ml（12ml离心管）或1×108～5×108个细胞/5ml（50ml离心管）。
 
2、用移液器吸取3ml（使用12ml离心管时）或5ml（使用50ml离心管时）高密度溶液，将枪头伸到离心管底，缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方。
 
3、室温，800g离心15min。为了取得好的分离效果，将离心机的“brake”开关关掉。
 
4、使用5ml移液器，沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头，吸入漂浮在高密度层上方的活细胞，尽量少收集高密度溶液。将活细胞移入另一管中。
 
5、加入RPMI-5*培养基（少量细胞加入10ml，细胞量较多时加入40ml），室温，200g离心10min。重复一次。
 
6、以适量培养基混悬细胞以便进行下一步操作。