T淋巴细胞的分离技术

（一）原理
混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。

（二）材料及试剂
1．尼龙毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。

（三）操作方法
1．尼龙毛的清洗与干燥
（1）戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g）放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
（2）冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。
（3）重复（1）、（2）步骤6次。
（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内。

2．装尼龙毛柱
（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。
（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠，以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积。
（3）将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。

3．细胞分离
（1）将注射器固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。
（2）将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×107个细胞／ml。
（3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。盖上注射器，37℃温育45min
至1h。
（4）打开下口，缓慢放流（1滴／min），收集于离心管中。
（5）离心，即获所需的T淋巴细胞。
（6）关闭注射器下口，于注射器内加入0.85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。

（四）注意事项
1．此种分离法，T淋巴细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量有关，与装柱的松紧也有关系。
2．此法的T淋巴细胞的回收率约20％～30％。
3．用过的尼龙毛可回收，以盐水洗涤，然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜，然后再同前法清洗