小鼠脾脏树突细胞的分离-胶原酶消化制备脾脏细胞悬液
2010-07-16
[2662]
辅助方案:
胶原酶消化制备脾脏细胞悬液
实验材料:
1. 4000U/ml胶原酶D,融化后置于冰上
2. HBSS,已灭菌,含Ca+、Mg2+(购置于Life Technologies)
3. 小鼠脾脏
4. 皮下注射针,22G×11/2in内径(Becton Dickinson)
5. 10ml、5ml一次性注射器(如Becton Dickinson)
6. 100mm直径培养皿(如Falcon)
7. 2个高压灭菌锅的锯齿状解剖镊(如Roboz)
8. 高压灭菌的不锈钢网:将40目的不锈钢网剪成5cm×5cm的小方格,向下折叠边缘,然后将四边弯成浅的矩形碗;锡箔纸包裹后高压灭菌。
实验方法:
1. 将2管1ml的4000U/ml胶原酶D稀释(足够用于20个脾脏):1ml加入9ml HBSS(稀释至4000U/ml,步骤8使用),1ml加入39ml的HBSS(稀释至100 U/ml)。置于冰上。
2. 将22G针头连接在10ml的注射器上,充满100 U/ml的胶原酶。将10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培养皿中。
3. 取另外一个直径100mm的培养皿进行操作。一只手拿镊子,另一只手拿注射器,拇指放在活塞上。用镊子夹住小鼠脾脏,用针头刺入脾脏被膜的狭窄边缘,注入100 U/ml胶原酶100ml。用镊子将脾脏推向针头,使针头前进几毫米。重复注射胶原酶,继续直到1ml胶原酶都注射入脾脏,针头从另一端刺穿脾脏。
4. 用针头撕开脾脏,将其转移至含胶原酶的培养皿中(步骤2)。重复操作,直到所有脾脏都注射和撕开。
5. 从第二个培养皿中收集细胞悬液加入到置于冰上的50ml离心管中。用3ml 100 U/ml的胶原酶漂洗培养皿后加到上述50ml离心管中。
6. 加入3ml 100 U/ml胶原酶至培养皿中。将撕碎的脾脏依次转移至培养皿。用2个镊子将它们撕成边长1mm的小碎块,使其能通过5ml吸管的内径。当所有的脾脏都撕碎后,将先前放置脾脏碎块的培养皿中的胶原酶溶液加入进来,用5ml吸管猛烈吹打多次。
7. 倾斜培养皿,将大块碎片除开,将细胞悬液转移至第5步的置于冰上的50ml离心管中。用几毫升100 U/ml的胶原酶洗涤培养皿后加入至离心管中。
8. 在培养皿留下的脾脏碎块中加入10ml 400 U/ml的胶原酶。吹打数次后于培养箱里放置30-90min。
9. 在孵育的zui后阶段,猛烈吹打碎片,将其吸至直径100mm培养皿的无菌钢网上。
10. 用镊子固定钢网一端,用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤碎块,然后用无菌的5ml注射器活塞碾磨碎块。捣烂直到所有的红色物质从组织中去除。再用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤钢网。
11. 将钢网从培养皿中拿开,丢弃无色的黏附的被膜碎块。猛烈地吹打培养皿中的液体,将其转移至步骤7的50ml离心管里。用几毫升100 U/ml胶原酶洗涤培养皿后一同加入到离心管中(约有0.5%为树突细胞或者更少)。
12. 如果需要,即可用高密度的BSA离心。
附录:
抗体偶联的绵羊红细胞(EA):
以PBS洗涤2.5ml收集的绵羊红细胞(Alsever液中提取;Cocalico)3次,每次洗涤后均以350g离心5min。然后用新鲜PBS稀释为5%细胞悬浮液(109个细胞/ml)。将高致敏的兔抗红细胞血清于5%细胞悬液以1:50稀释(可能形成亚凝集剂量的抗体)。室温下孵育2h,偶尔温和地颠倒溶液。用RPMI1640(Life Technologies)洗涤形成的EA3次,随后以PBS将EA稀释为5%细胞悬液。于4℃保存2周,使用前再以RPMI洗涤一次。
RPMI-5*培养基:
RPMI1640培养基(Life Technologies),含有:
5%FBS,56℃热灭活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸庆大霉素(Life Technologies)
50mmol/ml 2-ME
过滤除菌
高密度BSA溶液:
在1L容量瓶中,加入186ml PBS,29ml 1mol/L NaOH,65ml水(小心操作,注意液体不要再瓶内飞溅)。不要搅拌,将106g BSA(Cohn fraction V,推荐采用*BSA)铺在溶液表面,盖上锡纸,冷藏过夜,使BSA慢慢溶解。
第二天,温和摇晃已变为澄清、微褐色的溶液;测量折射指数,到小数点后第四位。25℃条件下,正确密度的BSA(1.080g/ml)的折射指数在1.384-1.385。为校正折射指数后,用试纸检测pH。pH应在7.0-7.4,一般无需调整。
无菌过滤溶液。将47mm滤膜(Millpore type)置于一个500ml的过滤装置(Nalgene#156-4045)顶部,先以少量BSA润湿滤膜。真空抽滤数分钟,直到BSA滤出为止。取下真空泵,小心将剩余的BSA溶液加入滤器上部的储存器中(避免起泡沫。使用真空泵和滤器过滤剩余的BSA,≥10min)。4℃可保存3个月。
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