ELISA试剂盒方法与硝酸纤维素膜微粒介绍

1　实验方法

1.1　混合抗原直接测试　
按豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析文章讲述的方法［1］，将1.2ml大鼠原血清加入7.0ml10％丙烯酰胺溶液，聚合后在10°C、200mA、2h条件下大鼠血清蛋白电泳吸附于NC膜，用蒸馏水漂洗后，切一10×100mm小条装入10ml试管备用。对照组将同样面积空白NC膜用蒸馏水漂洗后备用。ELISA试剂盒在上述装有NC膜的试管中加入10ml DMSO，充分摇匀，室温1h；加入等体积0．1mol／L　pH9．0碳酸氢钠溶液，充分混匀。3000r／min离心3～5min，收集沉淀，即为含大鼠血清蛋白的NC膜微粒，用0．01mol／L　pH7.4　PBS-T洗涤离心3×5min；用含0.3％的1：50正常羊血清封闭、阻断37°C30min或4°C冰箱；同上离心后用PBS将微粒体积调至5ml、用0.5ml离心管分装，每管加入100μl微粒悬浊液；在各管中分别加入100μl倍比稀释的HRP-羊抗鼠，37°C孵育30min；同上洗涤离心3次，加入100μl含0.1mol／L柠檬酸、0.2mol／L磷酸氢二钠、双氧水、邻苯二胺底物溶液，于37°C暗环境反应120min；每管加入1滴2mol／L硫酸终止反应，同上离心，收集上清并加入96孔ELISA试剂盒酶联板，用酶标仪测试波长490nm处OD值。重复测试3次。

1.2　电泳分离抗原测试　
首先免疫转印鉴定抗原，ELISA试剂盒再根据免疫转印结果进行定位，将特定抗原带裁下，测量NC膜面积，同上将NC膜微粒化处理并进行定量免疫测试。

2　实验结果

用混合抗原直接测试和用电泳分离抗原进行测试，抗体浓度与OD值间均有较好线性关系，当抗体浓度为0.25～1．0ng／ml时线性，且阳性组和阴性对照组OD值落在*范围（见表1），即阴性对照组OD值为0.3左右，阳性对照组为1.0左右。3次重复结果一致。
3　讨论
用ELISA法进行测试时，包被条件非常关键，对用于包被的抗原或抗体要求较高，其应用范围受限制。NC膜具有很强的吸附能力，从而出现了以该材料为基础的斑点免疫检测法［2～4］。其对被吸附的抗原要求不高，粗制抗原便可用于检测，但吸附时间长、费时，被吸附抗原如果含有表面活性剂便不能用于检测。为了克服上述缺点，我们曾建立了一种电泳吸附斑点免疫法［1］，但该法需要将NC膜逐一截成小圆片放入酶联板中，操作也不方便，定量不够准确。NCMPE法将电泳吸附抗原的NC膜变成微颗粒，分装方便，能保证其均一性，定量准确，由于在离心管中操作、洗涤等处理极为方便。免疫转印技术是抗原抗体检测方面的重大突破，但应用该方法难以将抗体定量。NCMPE法将免疫转印识别的特定抗原带处理成微颗粒，然后用ELISA试剂盒法定量测试抗体水平，充分发挥了免疫转印技术的高分辨率和ELISA定量法的高度性与高度灵敏性，可极为方便而准确地将某种未知抗体定量。