多肽合成的原理及应用
2009-08-24
[5303]
多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。到现在，人们已在人体中发现和分离出一百多种肽类，关于多肽的研究与应用，也取得了巨大的进步，引发了的研究热潮。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值，多肽研究成为了医学和分子生物学研究的重点对象，世界各先进国家无不拨出巨款来建立各种规模的多肽研究中心，以期在这一重要领域中取得突破性进展。现在具有生物活性的多肽已经广泛地应用在临床检测、医学研究、疾病防治和治疗等三大方面。
1，多肽合成的原理与步骤
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法*的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。
1.1多肽合成基本原理：
先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，zui后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。
1.2固相多肽合成的步骤：
A，树脂的选择及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的载体主要有3类：交联聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂类树脂。氨基酸的固定主要是通过保护的氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成共价键来实现。
B，氨基、羧基、侧链的保护及脱除
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去，近年来，FMOC合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法。
C，成肽反应
固相中的成肽反应一般是将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的缩合剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。
D，裂解及合成肽链的纯化
BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。
2.固相多肽合成的应用——多肽合成仪
多肽固相合成技术的发明同时促进了多肽合成的自动化。世界上*台真正意义上的多肽合成仪出现在1980年代初期，它是利用氮气鼓泡来对反应物进行搅拌，用计算机程序控制来实现有限度的自动合成。虽然在各项功能方面有着明显的缺陷，但是它毕竟把人从实验室里解放出来，极大地提高了工作效率。
随着多肽科学的发展，科学家也对合成仪提出了更高的要求，从而带动了合成仪的发展。目前多肽合成仪品种繁多。从合成量上分，可分为微克级的，毫克级的，克级的和公斤级的；从功能上分，可分为研究型的，小试型的，中试型的，普通生产型的和GMP生产型的；从自动化程度上分，可分为全自动的，半自动的和手动的；从通道上分，可分为单通道的和多通道的；从技术角度上分，可分为*代的，第二代的，和第三代的；等等。
*代多肽合成仪标志性特点是采用氮气鼓泡的搅拌原理来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但各项功能方面有着明显的缺陷，目前采用氮气鼓泡方式的*代多肽合成仪已大部分退出了市场。
第二代多肽合成仪标志性特点是用不*性的机械搅拌来取代氮气鼓泡，一般可分为接触式搅拌与非接触式搅拌两种。
接触式搅拌常见的搅拌方式是伸入反应器内部的螺旋桨由上部的电机带动进行快速旋转，使反应器内部的固液两相进行混合。但搅拌方式带来的不利因素如清洗障碍，合成量低，反应死角等也不容忽视，目前*共大多数多肽合成仪生产厂商放弃了接触式搅拌方法。
机械性非接触式搅拌的主要原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。这种由反应器本身的运动而带动里面固液两相混合的方法克服了接触式搅拌带来的缺点，合成产量和纯度也明显好于用氮气鼓泡的*代合成仪。所以机械性非接触式搅拌成为了多肽合成仪的主流。但是由于这种搅拌方法不能真正消除反应死角，所以科学家们并没有满足而停下他们追求的脚步。
第三代多肽合成仪其反应器转动方式有别于前两代的多肽合成仪，即反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的zui上方，真正做到了*。*多肽合成仪的另一种方式是反应器在数控马达的带动下作上下180度的翻转运动。固相和液相在运动过程中不断从反应器的一端到达另一端再返回来。一般用这种仪器合成出来的肽纯度是zui高的，且适合于扩大生产。
<<抗血清的制备
1，多肽合成的原理与步骤
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法*的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。
1.1多肽合成基本原理：
先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，zui后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法。
1.2固相多肽合成的步骤：
A，树脂的选择及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的载体主要有3类：交联聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂类树脂。氨基酸的固定主要是通过保护的氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成共价键来实现。
B，氨基、羧基、侧链的保护及脱除
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去，近年来，FMOC合成法得到了广泛的应用。羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法。
C，成肽反应
固相中的成肽反应一般是将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的缩合剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。
D，裂解及合成肽链的纯化
BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。
2.固相多肽合成的应用——多肽合成仪
多肽固相合成技术的发明同时促进了多肽合成的自动化。世界上*台真正意义上的多肽合成仪出现在1980年代初期，它是利用氮气鼓泡来对反应物进行搅拌，用计算机程序控制来实现有限度的自动合成。虽然在各项功能方面有着明显的缺陷，但是它毕竟把人从实验室里解放出来，极大地提高了工作效率。
随着多肽科学的发展，科学家也对合成仪提出了更高的要求，从而带动了合成仪的发展。目前多肽合成仪品种繁多。从合成量上分，可分为微克级的，毫克级的，克级的和公斤级的；从功能上分，可分为研究型的，小试型的，中试型的，普通生产型的和GMP生产型的；从自动化程度上分，可分为全自动的，半自动的和手动的；从通道上分，可分为单通道的和多通道的；从技术角度上分，可分为*代的，第二代的，和第三代的；等等。
*代多肽合成仪标志性特点是采用氮气鼓泡的搅拌原理来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但各项功能方面有着明显的缺陷，目前采用氮气鼓泡方式的*代多肽合成仪已大部分退出了市场。
第二代多肽合成仪标志性特点是用不*性的机械搅拌来取代氮气鼓泡，一般可分为接触式搅拌与非接触式搅拌两种。
接触式搅拌常见的搅拌方式是伸入反应器内部的螺旋桨由上部的电机带动进行快速旋转，使反应器内部的固液两相进行混合。但搅拌方式带来的不利因素如清洗障碍，合成量低，反应死角等也不容忽视，目前*共大多数多肽合成仪生产厂商放弃了接触式搅拌方法。
机械性非接触式搅拌的主要原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。这种由反应器本身的运动而带动里面固液两相混合的方法克服了接触式搅拌带来的缺点，合成产量和纯度也明显好于用氮气鼓泡的*代合成仪。所以机械性非接触式搅拌成为了多肽合成仪的主流。但是由于这种搅拌方法不能真正消除反应死角，所以科学家们并没有满足而停下他们追求的脚步。
第三代多肽合成仪其反应器转动方式有别于前两代的多肽合成仪，即反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的zui上方，真正做到了*。*多肽合成仪的另一种方式是反应器在数控马达的带动下作上下180度的翻转运动。固相和液相在运动过程中不断从反应器的一端到达另一端再返回来。一般用这种仪器合成出来的肽纯度是zui高的，且适合于扩大生产。
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