常见问题及解答

1.如何测定引物的OD值？
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度稀释到0.2-0.8之间（吸光度太高或太低会有较大的误差）。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。
举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎样溶解引物？
我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

3.合成的引物应如何保存?
没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。

4.如何检测引物的纯度？
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95oC,2mins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的（有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带）。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?
没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。

6.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?
PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。
1） 引物和模板是否配对，同源性有多大?
2） 引物本身是否有立体结构.
3） PCR反应用试剂是否能正常工作?
4） PCR仪是否工作正常?
5） PCR反应条件是否合适?
如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。

7.测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8，引物的纯度合格吗?
由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度（比值在1.8～2.0之间），这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 （通常在20～30个碱基之间），其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同， 例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

8.上海生工公司可以合成多长的序列？
由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要，我们愿意接受110碱基以下的订单。

9.PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？
我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您：
1） 可以要求我们重新免费合成引物。
2） 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能.

10.如何将两条互补的单链退火形成双链？
用退火缓冲液（10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA）溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温（低于30度）即可。退火的产物可以放在4度待用。

11.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?
对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。

12.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?
不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

13.2OD的引物可以多少做次PCR反应？
一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物zui少可以做400次PCR反应。

14. DNA合成粗产物中含有什么杂质？
DNA合成仪合成的粗产物，其中除了含有所需的目的DNA片段以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段以及脱保护基团产生的铵盐，本公司提供的引物已全部通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。

15.引物在常温下运输，会降解吗？
不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

16.为何长链引物的收费要比短链引物要高？
通常在合成长链引物时，试剂的加入量要比短链引物要多很多，尤其是大于90bp的碱基以上的引物，由于成本的增加，从而导致价格也要高一些。
 
 
    
  PCR产物DNA测序错误的原因
　 一、Taq酶原因

本公司现为世界上zui大的合成DNA专业公司之一,每天为世界各地用户合成约2100条引物。在这些大量的引物中大多用于PCR扩增,约有万分之五左右的在DNA测序后,发现在引物部分有错误,错误大部分表现为丢失。许多用户认为这种错误是我们公司合成错误造成的。 实际上这种错误是由于Taq酶固有的错误概率造成的,与合成无关。请看如下示意图:

从图可以清楚的看出，引物部分也被Taq扩增，既然引物也被扩增，那么错误就可能发生。 那么化学合成DNA会不会发生错误呢? 回答是否定的。 错误无非有两种:一是碱基被置换；二是碱基丢失。本公司的80多台DNA合成仪全部为ABI公司产品，ABI的DNA合成仪是世界上zui可靠的，至今尚未听说过ABI的DNA合成仪在合成一个碱基时（例如A），却错误地加上另一个碱基（G,C or T），丢失更不可能。因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保护基（DMT）、碱基的加成、盖帽（Capping）、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因（如瓶中溶液没有了，或管道堵塞），未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。 可见，以上PCR产物测序时发生在引物部分的错误不是引物合成的失误，而是Taq酶造成的。

二、化学原因

在合成过程中，如果本公司提供的DNA合成报告单是正确的，表示合成是成功的。人为因素造成碱基突变的可能性是*可以排除的。DNA合成专家Dr. Hecker和Dr. Rill对此作了一评论 （Error Analysis of Chemically Synthesized Polynucleotides Biotechniques，1998.Feb.24：256-60），认为化学合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清楚，但可以肯定的是要保证100％不发生错误是不可能的。zui近，Dr. Jacek Lubkowski 在《Nucleic Acids Research》（2002，Vol. 30, No. 10 e43） 上发表了一篇文章也证实了化学合成引物（非人为错误）会导致错误，而且引物链越长，错误概率越高。原文如下：while this method is simple in principle, in practice numerous complications can lead to errors in the synthesis. To reduce the possibility of errors during oligonucleotide synthesis, the oligonucleotides should be rather short, yet they must still be long enough to provide stable priming overlaps.

三、解决的办法:
1.  建议用高保真的高温聚合酶，如本公司推出的Super Pfu、Pfu 、Taq plus等，保真性比Taq酶高10倍左右，可有效的减少差错。
2.  再挑选一个克隆进行DNA测序，一般来说再次出现错误的可能性就更小了。
3. 重新合成引物。
4. 将您有缺失碱基的克隆送到我们基因部，我们负责将缺失的碱基进行点突变，提供您所需要得正确序列。 但由于客户的载体非常复杂和多变，我们承诺的是提供

 DNA损伤的来源
1.1 碱基脱落形成AP位点
热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落，形成AP位点（Apurinic orApyrimidinic site ）。
烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点。
1.2 碱基的改变
①物理因素
电离辐射可引起其它物质产生自由基，从而引起碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。
一般嘧啶比嘌呤更敏感。
②化学因素
a. 烷化剂
*、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化剂可将烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使碱基烷基化。
鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3zui容易受攻击，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤碱基，导致复制时碱基错配。
例如鸟嘌呤N7被烷化后会与T配对，结果会使G-C转变成A-T。
b. 碱基类似物
5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它们的结构与碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。
如5-BU与T结构相似，在酮式结构时与A配对；它更易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C。
c. 黄曲霉素
黄曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入碱基序列，引起移码。
d. 硝酸盐
亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。
③碱基的自发改变和损伤
a. 碱基的异构互变
4种碱基各自的异构体间都可自发地互变（烯醇式与酮式间的互变），这会使碱基间发生错配，使A-C、T-G等。
b. 碱基的脱氨基作用
碱基的环外NH2有时会自发脱落，使C→U、A→次黄嘌呤（I）、G→黄嘌呤（X）等，DNA复制时，U-A、I-X、I-C配对，导致子代DNA序列错误。
5-甲基胞嘧啶脱氨基产生T（引起C-G→T-A的变化），而C脱氨基产生U（它通常被移出或被C代替）。
④氧自由基伤害
细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
1.3 碱基插入或缺失
吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插入一个碱基。
DNA聚合酶在复制过程中发生滑动，尤其在连续几个相同碱基的区段产生1个或几个碱基的缺失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺失，在生长链上滑动易于造成插入。
插入或缺失会导致读码框改变。
1.4 嘧啶二聚体
DNA受到紫外线照射时，使DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。
相邻2个T；或2个C；或C与T间都可形成环丁基二聚体；相邻2个T间zui易形成TT二聚体。
1.5 DNA链断裂
电离辐射可使DNA链断裂；射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。
烷化剂也可使DNA链断裂；DNA链的磷酸二酯键上的氧易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。
对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。